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重組人胰島素類似物的HPLC分析

更新時間:2016-01-26      點擊次數(shù):3447

重組人胰島素類似物的HPLC分析

 

目的:探討HPLC分析在重組人胰島素類似物鑒別和雜質(zhì)檢測中的適用性。方法:采用反相色譜柱(C18),以硫酸鈉-磷酸緩沖液(0.2mol.L-1,pH2.3)和乙腈為流動相,流速0.8或1.0mL.min-1,柱溫40℃,檢測波長214nm;用分子篩柱(ZorbaxGF250)以磷酸銨緩沖液(0.1mol.L-1,pH7.5)和乙腈為流動相,流速0.5mL.min-1,檢測波長214nm;檢測重組人胰島素類似物及其酶解片段。結(jié)果:獲得胰島素及其類似物的RP-HPLC圖譜,肽圖譜和體積排阻色譜(HPSEC)圖。結(jié)論:本文方法能夠有效地區(qū)別和檢測胰島素類似物及有關物質(zhì),為該類藥物的質(zhì)控提供了科學依據(jù)。

  關鍵詞:重組人胰島素類似物肽圖譜反相液相色譜體積排阻色譜

  重組人胰島素類似物(rhInsulinlispro)是重組人胰島素分子B鏈上第28位的脯氨酸和第29位的賴氨酸位置互換產(chǎn)物。其降血糖作用更迅速。臨床上作為快速降糖藥物,其制劑的商品名為優(yōu)泌樂(HumalogTM),該藥已被FDA批準上市,并進口我國。在藥品檢驗中,如何區(qū)分一級結(jié)構(gòu)僅有微小差別的人胰島素和人胰島素類似物,本文試用RP-HPLC法和HPSEC法對其分子或酶解片段進行了分析。

  1、儀器與材料

  1.1儀器島津LC-10AD泵、CTO-10A柱溫箱、SPD-10A檢測器、DGU-4A脫氣機、C-R7Aeplus積分儀。

  1.2材料重組人胰島素類似物(rhInsulinlispro)對照品及其注射液(HumalogTM)、B30脫蘇氨酸重組人胰島素由美國Elilly公司提供;重組人胰島素對照品、重組人胰島素-A21脫氨人胰島素對照品、豬胰島素-A21脫氨豬胰島素對照品、重組人胰島素類似物單體-二聚體對照品(中國藥品生物制品檢定所);重組人胰島素為國產(chǎn)原料;V8蛋白酶為Sigma產(chǎn)品;乙腈為色譜純試劑,其它試劑均為國產(chǎn)分析純。

  2、方法與結(jié)果

  2.1 肽圖譜測定取重組人胰島素類似物對照品、重組人胰島素對照品和B30脫蘇氨酸重組人胰島素適量,用0.1%的CF3COOH溶液制成每1mL中含10mg的溶液;取20μL,加0.2mol.L-1Tris-鹽酸緩沖液(pH7.3)20μL,0.1%V8蛋白酶溶液20μL,水140μL,混勻,置37℃水浴2h后,加85%的磷酸溶液3μL終止反應,作為酶解樣品溶液;另取重組人胰島素類似物對照品、重組人胰島素對照品和B30脫蘇氨酸重組人胰島素適量,以水代替V8蛋白酶同法制備非酶解樣品溶液。采用Vydac Protein and Peptide C18色譜柱(250mm×4.6mm);柱溫40℃;流速1.0mL.min-1;檢測波長214nm;以0.2mol.L-1硫酸鹽緩沖液(pH2.3)-乙腈(90∶10)為流動相A,乙腈-水(50∶50)為流動相B;進行梯度洗脫。初始狀態(tài)為10%B,5min時流動相B增至20%,45min時流動相B增至60%,保持5min。取上述酶解樣品溶液和非酶解樣品溶液各20μL分別注入液相色譜儀,記錄色譜圖。

  1. 重組人胰島素類似物酶解樣品

  2. B30脫蘇氨酸重組人胰島素酶解樣品

  3. 重組人胰島素酶解樣品

  4. 重組人胰島素非酶解樣品

  5. 重組人胰島素類似物非酶解樣品Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ—人胰島素酶解片段代號

 2.2  RP-HPLC鑒別取重組人胰島素-A21脫氨人胰島素對照品、牛胰島素、豬胰島素-A21脫氨豬胰島素對照品和重組人胰島素類似物對照品適量,各用0.01mol.L-1鹽酸溶液分別制成每1mL中含2.8mg的溶液,取上述4種溶液等體積混合,制得混合樣品溶液;采用SpherisorbODSⅡ(100mm×4.6mm)色譜柱;流速0.8mL.min-1;柱溫40℃;檢測波長214nm;以0.2mol.L-1硫酸鹽緩沖液(pH2.3)-乙腈(75∶25)為流動相。分別取各種胰島素溶液和混合樣品溶液各20μL注入液相色譜儀,記錄色譜圖,確定不同保留時間對應的成分。

 2.3  RP-HPLC分析重組人胰島素類似物及有關物質(zhì)取A21脫氨人胰島素類似物對照品適量,用0.01mol.L-1鹽酸溶液制成每1mL中含3.5mg的溶液作為系統(tǒng)適用性樣品溶液;取重組人胰島素類似物注射液,用0.01mol.L-1鹽酸溶液調(diào)pH約為5.3時,其中重組人胰島素類似物形成白色沉淀,4000g離心10min,取上清液作為空白注射液;采用Vydac Protein and Peptide C18色譜柱(250mm×4.6mm);柱溫40℃;流速1.0mL.min-1;檢測波長214nm;以0.2mol.L-1硫酸鹽緩沖液(pH2.3)-乙腈(82∶18)為流動相A;0.2mol.L-1硫酸鹽緩沖液(pH2.3)-乙腈(50∶50)為流動相B,洗脫梯度初始狀態(tài)流動相B為19%,保持60min,在23min內(nèi)流動相B增至49%,保持5min。取上述樣品溶液和重組人胰島素類似物制劑空白各20μL注入液相色譜儀。

 2.4  HPSEC分析取重組人胰島素類似物原料、重組人胰島素類似物制劑、重組人胰島素類似物單體-二聚體對照品用流動相制成濃度為每1mL約含0.7mg(20U)的溶液。采用ZorbaxGF250Special(25cm×9.4mm)分析色譜柱;以0.1mol.L-1磷酸銨緩沖液(pH7.5)-乙腈(65∶35)為流動相;流速0.5mL.min-1;檢測波長214nm。取上述樣品溶液20μL注入液相色譜儀,記錄色譜圖。

  3、討論

 3.1 鑒別重組人胰島素類似物的分子結(jié)構(gòu)如圖5所示。實驗中使用的V8蛋白酶能專一裂解谷氨酸的羧基端肽鍵。在非還原條件下,用V8酶水解重組人胰島素類似物分子,理論上可產(chǎn)生4個片段,即Ⅰ(A5-17與B1-13)、Ⅱ(A18-31與B14-21)、Ⅲ(B22-30)、Ⅳ(A1-4)。而在本實驗條件下,則多了一個中間片段,即Ⅴ(A1-17與B1-13),這是片段Ⅰ和Ⅳ聚合的結(jié)果。人胰島素和B30脫蘇氨酸人胰島素以及重組人胰島素類似物的酶解片段Ⅰ、Ⅱ、Ⅳ和Ⅴ的保留時間是相同的,分別為1460、730、220和1600s,但片段Ⅲ的保留時間則有差別,分別為660和550以及630s。由此可見,通過肽圖譜分析鑒別胰島素類似物是非常有效的。由圖2可見,本文的RP-HPLC方法能有效地區(qū)分人、豬、牛胰島素和重組人胰島素類似物。此法快速、不受其它成分干擾。

 3.2 雜質(zhì)分析重組人胰島素類似物在高溫高濕度條件下,易產(chǎn)生高分子量蛋白(HMWP),如在40℃,75%相對濕度下,HMWP的增加速率為每天0.16%;而在酸性條件下,易形成脫氨產(chǎn)物,如其酸性溶液在室溫放置時,A21脫氨重組人胰島素類似物的增加速率為每天0.6%。本文據(jù)此制備系統(tǒng)適用性樣品,在RP-HPLC線性梯度洗脫分析中,重組人胰島素類似物與其A21脫氨產(chǎn)物的分離度為2.6,按重組人胰島素類似物峰計算,其理論塔板數(shù)為5350;而在HPSEC分析中,分離度以二聚體峰高與單體和二聚體間的峰谷高之比表示,其值應大于2.0,按重組人胰島素類似物單體峰計算,其理論塔板數(shù)為6200。

  綜上所述,本文方法能有效地區(qū)分人、牛、豬胰島素與人胰島素類似物,能檢測分離人胰島素類似物及有關物質(zhì)和高分子量蛋白。結(jié)果為該類藥物的質(zhì)控提供了科學依據(jù)。

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